4种检测正在翻译的mRNA的方法 | 翻译组
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上期说到，转录组和蛋白质组相关性差的原因是因为从mRNA到蛋白质，中间要经过复杂而精细的翻译调控，这个阶段的调控占所有调控比例的50%以上，是细胞内最重要的调控方式。研究翻译调控即为翻译组学。讨论翻译组学，首先关注的就是正在翻译的mRNA，它是蛋白质合成的信息蓝图。请注意，并不是所有的mRNA都会翻译成蛋白质。
翻译组的检测技术最早要追溯到上世纪60年代的多聚核糖体分析技术(polysome profiling)，此后技术不断发展进步，又出现了多种不同的检测技术，这里我们选取其中四种检测技术为大家做介绍。
图1三种翻译组检测技术[1]
多聚核糖体分析技术(polysome profiling)
Polysome profling是利用核糖体沉降系数较大的特性，用蔗糖密度梯度离心的方法分离多聚核糖体。一条mRNA上结合的核糖体数量越多，在梯度离心时的沉降速率就会越快，因此结合有不同数量核糖体的mRNA通过离心就可以在溶液中分开。然后可以对分离出来的各组分中的mRNA进行分析（图1左）。然而，由于采用蔗糖密度离心的方法，回收到的正在翻译的mRNA量较低，难以满足全谱分析所需的样品量。
Ribosome Affinity Purification(RAP, 或称Translating RAP, TRAP)
通过用组织特异性启动子表达结合核糖体大亚基的L25蛋白质，并在C端连接亲和标签，转化细胞，然后使用抗体将含有标签的核糖体抓取下来，即可获得结合在此类核糖体上正在翻译的mRNA，然后进行分析（图2右）[2]。该方法需要对细胞系进行稳转使其表达含标签的核糖体蛋白，如用于动植物个体则需要先构建转基因动植物，操作较为复杂繁琐，实验周期长。并且过表达核糖体蛋白也会干扰正常的生理状况，使得翻译失真。因此，这种技术的应用会受到一定的限制。
Ribosome profiling技术(又称Ribo-seq)
此方法是目前较为常用的检测正在翻译的mRNA的技术。首先使用低浓度RNase处理核糖体-新生肽链复合物，降解掉没有核糖体覆盖的mRNA片段，最后对获得的被核糖体保护的约22~30 bp的RNA小片段(称为Ribosome FootPrints, RFPs；或者称Ribosome Protected Fragments, RPFs)进行测序分析（图2中）[3]。使用此方法可获得每种正在翻译的转录本上核糖体的分布，推测起始密码子位置(包括非ATG起始)以及uORFs等信息。然而该方法只能分析有核糖体结合的蛋白编码区域(CDS)，不能获得非翻译区段(UTR)的信息。
RNC-Seq
RNC-Seq是在Polysome profling方法的基础上，由暨南大学张弓教授课题组采用RNC-mRNA(RNC表示Ribosome-Nascent-chain-Complex, 核糖体-新生肽链复合物)直接分离技术，使用单一浓度蔗糖溶液作为缓冲液，通过超速冷冻离心将核糖体组分与游离mRNA以及其他细胞组份分离开来。由于所有的核糖体组分都沉淀在管底，抽提沉淀中的RNA，即可得到RNC-mRNA。然后结合高通量测序即可获得所有正在翻译的全长mRNA信息（图2）[4]。此项技术难点在于RNC-mRNA复合体的分离，处理不当将得不到全长RNC-mRNA，并造成RNC-mRNA定量失准。而且也无法获得翻译过程中核糖体分布的位置信息。
图2 RNC-Seq实验原理
✕✕下一期我们来说说翻译组学领域的大牛在做些什么。
参考文献
1. King HA, Gerber AP. Translatome profling: methods for genome-scale analysis of mRNA translation. Brief Funct Genomics, 2016, 15(1):22-31.
2. Inada T, Winstall E, Tarun SJ, et al. One-step affinity purifcation of the yeast ribosome and its associated proteins and mRNAs. RNA, 2002, 8(7): 948-958.
3. Ingolia NT, Ghaemmaghami S, Newman JR, et al. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profling. Science, 2009, 324(5924): 218-223.
4. Wang T, Cui Y, Jin J, et al. Translating mRNAs strongly correlate to proteins in a multivariate manner and their translation ratios are phenotype specifc. Nucleic Acids Res, 2013, 41(9): 4743-475